产品介绍鼠尾基因型快速鉴定试剂盒
产品名称：鼠尾基因型快速鉴定试剂盒
货号：SW2100
产品规格：100 rxns ； 500 rxns
产品介绍
本试剂盒配备了整套的 DNA 粗提取及 PCR 扩增体系，可直接快速地对小鼠组织（如鼠尾、 鼠耳、 鼠趾、 肌肉等）样本进行 PCR 扩增，无需匀浆、 破碎、 过夜消化、 酚氯仿抽提、 DNA 沉淀或柱式纯化等操作，操作更加简单快速。试剂盒中配有 2×鼠尾直扩 PCR 预混液（含染料），包含特殊修饰的热启动 DNA 聚合酶、dNTPs 以及优化的缓冲体系。具有极高的扩增效率和抑制物耐受度，使用时只需加入模板和引物，并补水至 1×即可进行 PCR 反应，减少了开盖、 移液等操作， 显著降低样品交叉污染的风险， 并且提高了检测通量和结果的可重复性。 体系中预混有电泳缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳。 本试剂盒适用于10 kb 以内目的片段的扩增以及 4 对引物以内的多重 PCR 反应，可用于基因型快速鉴定、小鼠基因分型等。
储存和运输条件
2×鼠尾直扩 PCR 预混液（含染料）于-25 ~ - 15℃保存，其余组分 2 ~ 8℃保存。有效期 12 个月。
产品用途
用于小鼠基因分型、小鼠转基因检测、小鼠基因敲除分析。
产品组成
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组分/含量 |
100 rxns |
500 rxns |
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组织裂解液 |
20 mL |
5×20 mL |
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蛋白酶 K |
400 μL |
5×400 μL |
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2×鼠尾直扩 PCR 预混液（含染料） |
1 mL |
5×1 mL |
注：2×鼠尾直扩 PCR 预混液（含染料）组分中已包含 dNTPs、Mg2+ 、DNA 聚合酶、染料等。
使用方法
1. 基因组 DNA 的释放
1. 1 组织裂解液配制
根据需要裂解的小鼠样品数量配制裂解液，单个样品所需试剂比例如下：
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组分 |
体积 |
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组织裂解液 |
200 μL |
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蛋白酶 K |
4 μL |
注：裂解液应现用现配，且各组分添加完成后应涡旋振荡，充分混匀后再使用。
1.2 小鼠样品准备与裂解
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样本类型 |
小鼠尾尖 |
小鼠耳朵 |
小鼠脚趾 |
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推荐用量 |
1 ~ 3 mm |
2 ~ 5 mm2 |
1 ~ 2 个 |
将样品和新鲜配制的裂解液置于55℃水浴中孵育 30 min（对于5kb以内的目标片段，30 min 孵育已足以释放足量的 DNA 模板，大于 5kb 的目标片段，请适当延长孵育时间）。为保证 DNA 充分释放，请务必将组织全部浸没至裂解液中。孵育结束后组织块可能并未完全消化，属正常情况，不影响使用。
1.3 小鼠组织裂解产物预处理
孵育结束后，将样品置于 95℃或沸水浴中加热 5 min 灭活蛋白酶 K。然后将样品 12,000 rpm 离心 5 min，可以立即取上清进行 PCR 反应；或将上清转移至另一个灭菌 EP 管中，并置于-25 ~ - 15℃保存备用，保存时间为 2 周。
- PCR 扩增体系配制2×鼠尾直扩 PCR 预混液（含染料）完全解冻后上下颠倒混匀，于冰上配制如下反应体系：
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组分 |
20μL体积 |
50μL体积 |
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2×鼠尾直扩 PCR 预混液（含染料） |
10 μL |
25 μL |
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上游引物（10 μM） |
0.5 μL |
1.25 μL |
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下游引物（10 μM） |
0.5 μL |
1.25 μL |
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裂解产物 |
0.5 ~ 1 μL |
1 ~ 2.5 μL |
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ddH2O |
Up to 20 μL |
Up to 50 μL |
注：1.各组分使用前应充分混匀，配制好 PCR 反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，然后瞬时离心将反应液集于管底；2.PCR扩增体系中引物终浓度为 0.2 ~ 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可在 0.1 ~ 0.5 μM 范围内调整引物终浓度；3.裂解产物加入量不应超过 PCR 反应总体积的 1/10。
- PCR 反应程序设定
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Stage |
程序 |
温度 |
时间 |
循环数 |
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Stage 1 |
预变性 |
95 ℃ |
5 min |
1 cycle |
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Stage 2 |
变性 |
95 ℃ |
15 sec |
30 ~ 35 cycles |
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退火 |
55 ~ 72 ℃ |
20 sec |
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延伸 |
72 ℃ |
15 sec/kb |
||
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Stage 3 |
彻底延伸 |
72 ℃ |
5 min |
1 cycle |
注：退火温度需要根据引物 Tm值进行调整，一般设置为低于引物 Tm值 2~5 ℃即可。
4. PCR 产物电泳
PCR 扩增反应结束后直接取 3 ~ 5 μL 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 。本产品中已经预混有电泳缓冲液和染料 ，因此扩增产物无需再添加 DNA 上样缓冲液。
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常见问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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扩增产量低或者无法扩增 |
PCR 反应中加入的裂解液过量；或裂解液中混入了PCR 抑制物。 |
减少裂解液用量；或将裂解产物稀释 10 倍后再进行 PCR扩增；或增大 PCR 反应体系。 |
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模板加入量不适合。 |
裂解产物用量不应超过 PCR 反应总体积的 1/10。 |
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PCR 循环数不够。 |
增加 PCR 循环数以获得更好的扩增效果。 |
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循环反应退火温度设置太高。 |
降低退火温度（每次降低 3 ℃） 。 |
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PCR 引物错配严重。 |
重新设计引物。 |
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非特异性扩增 |
PCR 退火温度太低；循环数太多；或引物浓度/模板浓度太高。 |
升高 PCR 退火温度；减少 PCR 循环数；降低引物浓度或模板浓度。 |
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未在冰上配制 PCR 反应体系；或配制完成后放置时间太久。 |
PCR 反应体系的配制在低温下进行；配制完成后尽快进行 PCR 扩增反应。 |
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PCR 引物错配。 |
重新设计 PCR 引物。 |
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