细胞增殖-毒性检测试剂盒

Cell Counting Kit-8(CCK-8)

货号：K1008

储存条件：CCK-8 溶液在避光，0-5℃的条件下可以保存一年； -20℃下保存 2 年；如需经常使用请将试剂存放在 0-5℃，为防止背景值增加干扰实验结果，请勿反复冻融。

产品简介： CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度 检测试剂盒。WST-8 是一种类似于 MTT 的化合物，在电子耦合试剂 1-Methoxy PMS 存在的情况下，可以被还原生成橙黄色水溶性的甲臜（Formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

CCK-8试剂使用方法

一、通用操作步骤

1. 在 96 孔板每孔加入 100uL 细胞悬液； 2.在培养箱中预培养细胞；3.向培养板中加入药物(如果不加药物，直接进行第五步操作)；4.在培养箱中培养一段时间；5. 向每孔加入 10μL 的 CCK 溶液；6. 将培养板在培养箱内孵育 1～4 小时(根据具体实验优化)。7. 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度

二、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1.先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2.按比例(例如:1/2 比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。

3.接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X 轴)，OD 值为纵坐标 (Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK 后的培养时间)

三、细胞活性检测

1.在 96 孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在 37℃，5% CO2的条件下）。

2.向每孔加入 10 μL 的 CCK 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。

3.将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

4.用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。

5.如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

四、细胞增值-毒性检测

使用方法（以 96 孔板为例，其他规格培养板按实际情况安排）：

1. 在 96 孔板中配置 100μl 的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入 100μl 2000 个细胞，细胞毒性实验每孔加入 100μl5000 个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定）。按照实验需要，进行培养（在 37℃，5%CO2,的条件下）预培养 24 小时。

2. 向培养板加入 1-10μl 不同浓度的待测药物刺激。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（后面有具体细胞的建议时间，例如：6、12、24 或 48 小时）。

4. 每孔加入 10μlCCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。如果起始的培养体积为 200μl，则需加入 20μl CCK-8 溶液，其他情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和 CCK-8 溶液但没有加入细胞的孔作空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和 CCK-8 溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

5. 在细胞培养箱内继续孵育 1-4 小时，对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在 0.5、1、2 和 4 小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6. 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度，如无 450nm 滤光片，可以使用 420-480nm 的滤光片。可以使用大于 600nm 的波长，例如 650nm，作为参考波长进行双波长测定。

7. 如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10μl 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

8. 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

活力计算： 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100

A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度

A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

细胞增殖分析

细胞毒性分析

 注意事项：

1.由于使用 96 孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加 PBS，水或培养液；另一方面，可以把 96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2. CCK-8 检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

3.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

4.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入 CCK 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加样，溶液产生气泡，会干扰 OD 值读数。

5.当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔（100μl 培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2500 个/孔，（100μl 培养基），且培养时间长一些。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10%加入 CCK-8溶液。

6.加入 CCK-8 溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或 PH 值变化。建议换用新鲜的培养基。

7.如果没有 450nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490nm 之间的滤光片，但是 450nm 滤光片的检测灵敏度最高。

8.酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。